Bethyl 兔抗HIF1-α抗体，亲和纯化，精准检测缺氧稳定型全长蛋白，避免假阴性

一、产品概述由艾美捷代理Bethyl Laboratories推出的Bethyl 兔抗HIF1-α抗体亲和纯化货号A300-286A为兔源抗人/小鼠HIF-1αhypoxia-inducible factor 1-alpha蛋白C端区域第775–826位氨基酸之间的特异性多克隆抗体。HIF-1α是细胞应对低氧环境的核心转录因子与HIF-1β形成异源二聚体激活数百种靶基因如VEGF、EPO、GLUT1等的表达参与血管生成、代谢重编程、细胞存活及肿瘤进展。常氧条件下HIF-1α被VHL泛素化降解缺氧时稳定入核发挥转录活性。本抗体经抗原亲和纯化适用于免疫细胞化学/免疫荧光ICC-IF、免疫组化IHC、免疫沉淀IP及免疫印迹WB等多种应用是缺氧信号通路研究的关键工具。二、详细规格参数 | 规格靶标 | HIF-1α缺氧诱导因子1α反应种属 | 小鼠、人应用 | ICC-IF, IHC, IP, WB宿主 | 兔克隆性 | 多克隆形式 | 全IgG免疫原 | 人HIF-1α第776位至C端第826位之间的区域Swiss-Prot Q16665抗体类型 | IgG偶联物 | 未偶联纯度 | 抗原亲和纯化抗原种属 | 人浓度 | 200 ug/ml储存温度 | 2 - 8 °C有效期 | 自收货之日起1年缓冲液 | Tris缓冲盐水含0.1% BSA及0.09% 叠氮钠三、产品制备与质量控制本抗体采用固相载体固定的HIF-1α特异性C端表位进行亲和纯化。免疫原对应人HIF-1αGeneID 3091Swiss-Prot Q16665第775至826位氨基酸区域该序列在哺乳动物中高度保守且位于HIF-1α的C端反式激活结构域C-TAD内可有效识别缺氧稳定形式的全长蛋白。抗体经抗原亲和层析后免疫球蛋白浓度通过比尔定律测定1 mg/ml IgG在280 nm处吸光度为1.4。每批次质控标准Western blot在低氧处理如1% O2、CoCl2或DFO处理的人HeLa、HEK293或小鼠NIH/3T3细胞裂解液中检测到约100–120 kDa的特异性条带HIF-1α分子量约93 kDa但由于脯氨酸羟基化及磷酸化修饰电泳迁移率常显示为100–120 kDa常氧对照样品条带极弱或缺失。免疫沉淀6 ug/mg裂解物可从缺氧细胞核提取物中有效富集HIF-1α并检测到与HIF-1β的共沉淀。IHC/ICC-IF缺氧处理的细胞或肿瘤组织切片呈现核内或核浆聚集性染色常氧组织背景极低。四、推荐应用与实验条件所有Western blot实验建议使用5%脱脂牛奶-TBST作为封闭液和抗体稀释液一抗孵育条件为4°C过夜。以下为各应用的推荐起始条件应用 | 推荐稀释度/用量 | 备注Western Blot (WB) | 1:2000 – 1:10000 | 检测细胞裂解液时二抗推荐山羊抗兔IgGHL货号A120-101P检测免疫沉淀物时二抗建议使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体并在封闭液中加入5%正常猪血清货号S100-020以消除重链干扰。Immunoprecipitation (IP) | 6 ug/mg 裂解物 | 每毫克总蛋白使用6 ul抗体1 mg/ml浓度对应6 ug。推荐与Protein A/G磁珠或琼脂糖珠孵育2–4小时或过夜。Immunohistochemistry (IHC) | 1:100 – 1:500 | 对福尔马林固定石蜡包埋FFPE组织切片必须进行热诱导抗原修复使用枸橼酸盐缓冲液pH 6.0高压锅修复20分钟。也可试用Tris-EDTApH 9.0但pH 6.0效果更佳。Immunocytochemistry/Immunofluorescence (ICC-IF) | 1:100 – 1:500 | 细胞爬片固定后推荐4%甲醛建议进行抗原修复同上用枸橼酸盐缓冲液pH 6.0高压修复20分钟可显著增强核信号。若不做修复仅对低氧处理细胞也可能获得信号但修复可提高一致性。五、储存与稳定性储存条件2 - 8°C严禁冷冻。冷冻会导致抗体聚集和背景升高。有效期自收货之日起1年在2-8°C未稀释、避光保存。运输条件冰袋冷藏运输收货后请立即存放于2-8°C。防腐剂缓冲液含0.09%叠氮钠可抑制细菌生长。注意叠氮钠会抑制HRP活性若用于荧光检测则无影响如需去除请使用脱盐柱。六、注意事项1. 仅限科研使用不得用于临床诊断或治疗。2. 缺氧诱导是关键检测HIF-1α蛋白表达时必须设置缺氧处理组或使用蛋白酶体抑制剂如MG132否则常氧下信号极低易导致假阴性。3. 样品制备细胞裂解液中需加入蛋白酶抑制剂混合物及去泛素化酶抑制剂如NEM防止HIF-1α降解。推荐在缺氧环境中直接裂解细胞。4. 抗原修复必需对于IHC/ICC-IF石蜡切片或固定细胞必须进行热诱导抗原修复枸橼酸盐pH 6.0高压20分钟否则核信号缺失。5. 安全操作叠氮钠有毒操作时请佩戴手套。废液按有害物处理。6. 对照设置建议同时检测常氧与缺氧样本以及使用HIF-1α siRNA敲低或VHL过表达细胞验证抗体特异性。七、典型实验结果预期Western Blot在CoCl2100 uM4小时或低氧1% O₂6小时处理的HeLa细胞裂解液中1:5000稀释抗体可检测到约110 kDa的清晰条带常氧对照无条带或极弱。Immunoprecipitation从缺氧处理的HEK293核提取物中6 ug抗体/mg蛋白可沉淀HIF-1α洗脱物WB检测到预期条带同时可检测到共沉淀的HIF-1β。IHC人肾透明细胞癌常伴VHL失活HIF-1α组成性稳定FFPE切片显示弥漫性核强阳性癌旁正常肾组织核阴性。ICC-IF低氧处理的HeLa细胞呈现明亮的核内点状或均质荧光常氧细胞仅微弱胞浆背景。