病理分析前组织样本的脱水与透明标准操作要点解析

很多人以为组织脱水就是“泡酒精”泡完就行。其实里面的门道多着呢。一块新鲜的组织含水量高达70%以上而石蜡是油性的水火不相容。不把水彻底赶走石蜡就进不去切出来的片子要么全是空洞要么根本切不成形。脱水这一步直接决定了后续切片的质量。低浓度酒精才是真正的“急先锋”说到脱水大家总觉得高浓度酒精最重要恨不得上来就用无水酒精。但你可能想不到75%到80%的酒精穿透力才是最强的。这个浓度的酒精分子能快速钻入组织内部在短时间内把大量水分置换出来。它就像开路先锋先把大部队的“路”打通。而高浓度酒精呢它有一个特点——遇到水会剧烈反应如果组织固定得不够彻底高浓度酒精一上去就会让表面蛋白质快速凝固结一层硬壳。这层壳堵住了通道里面的酒精进不去水也出不来结果就是外面干了、里面还是湿的。这就是很多新手犯的错误一上来就用高浓度酒精最后组织脱水不均切片时中间软塌塌的根本没法看。温度不是越高越好有人觉得加加温、脱得快一点恨不得把酒精加热到五六十度。但温度一旦超过35到50度或者用丙酮这种烈性试剂组织就容易收缩、发硬、发脆。酒精在高温下会加速蛋白质凝固同时带走组织内部的结构支撑最后切出来的片子要么粉粉的、一丝一丝的要么一棱一棱的严重的整块往外崩。那什么温度最合适经验表明35度恒温是最理想的。这个温度既能加速脱水又不会损伤组织。所以有条件的实验室都会配备全自动脱水机一年四季恒温运行大大减少了人为变量。组织发脆到底是谁的锅很多技术员一看到切片发脆就怪酒精其实冤枉它了。组织发脆通常有三种情况第一种是固定没做好。新鲜组织如果没有及时用福尔马林固定细胞内的酶会开始自溶结构变得脆弱。这时候酒精一上去被迫充当了“替补固定液”把已经松散的蛋白质凝固起来结果就是组织变脆。第二种是组织本身的问题。比如小动物的肝脏质地本来就软嫩切片时温度一低就容易脆裂。这不是脱水的错而是切片条件需要调整。第三种最冤叫“假脆”。表面上看组织很脆一碰就碎但实际上是脱水没脱干净石蜡根本渗不进去。组织在六七十度的热蜡里被活活“烤”硬了内部水分蒸发、蛋白变性自然就脆了。这种情况在子宫肌瘤等较硬的组织中尤其常见切片时会一棱一棱的甚至整块往外崩。低浓度和高浓度的“接力赛”明白了原理就知道该怎么搭配了。低浓度酒精负责让组织软一点、收缩少一点切起来更舒服高浓度酒精负责把最后那点水彻底赶走。两者是接力赛的关系不是互相替代的关系。在35度恒温下一个比较稳妥的方案是75%酒精1.5小时85%酒精2小时95%酒精两道各1.5到2小时无水酒精两道也各1.5到2小时。大标本和小标本其实不用刻意分开处理小标本发脆多半不是因为脱水时间太长而是因为纸包太厚或者组织互相粘在一起水出不来。室温也有大影响很多人忽略了环境温度对脱水的影响。15度算是个分水岭。高于这个温度脱水会快一些可以适当缩短时间低于这个温度脱水效率下降就得延长。夏天和冬天的脱水程序如果完全一样出来的结果肯定不一样。最理想的解决方案就是前面说的——全自动脱水机一年四季恒温35度运行不受外界气温影响。换液不能靠“往前推”这是一个常见的操作误区。很多人为了省试剂习惯把95的酒精退给85用85的退给75用。这种做法看似节约其实隐患很大。因为退来退去低浓度酒精的浓度根本没法保证——85%的酒精退到75%那一缸实际浓度可能变成80%以上失去了低浓度酒精的强穿透力。正确的做法是同浓度的第二道可以退给第一道用但不同浓度之间不能乱退。95的酒精不能退给85用85的不能退给75用无水酒精更不能退给95用。要保证每个梯度的浓度是准确的这是脱水质量的基础。再说透明二甲苯没那么可怕很多人一提到二甲苯就紧张觉得它会让组织发脆恨不得跳过这一步。其实这个锅不该让二甲苯背。在固定充分、脱水彻底的前提下二甲苯并不会让组织变脆。恰恰相反对于子宫肌瘤这种比较韧的组织透明充分了反而更好切。因为二甲苯不仅能置换酒精还能溶解掉组织中的部分脂质让组织变得更加均匀透亮。那所谓的“脆”是怎么来的其实是蜡浸透之后组织恢复了它原本的质地在蜡块冰冻切片时产生的自然反应。如果换成冰水或者常温切片就不会觉得脆了。所以这不是二甲苯的问题是切片条件的问题。二甲苯透明一般两道各30到60分钟。时间长一点没关系透明越充分蜡也浸得越透。但有一个雷区如果组织里还残留了极少量水分二甲苯在高温下会把水置换出来造成组织“干烤”那才是真正导致发硬发脆的原因。总结一下脱水透明确实是个细活。低浓度酒精的穿透力、高浓度酒精的脱水力、温度的恒定、试剂浓度的准确每一步都环环相扣。哪一环出了问题最后的切片都会用最直观的方式告诉你——要么脆、要么软、要么粉、要么崩。本文内容参考自泰维科技-制片技术http://​https://www.taiva.com.cn/index.php?ccategoryid14​